Badania niekodujących regulatorowych wariantów liczby kopii jako przyczyny wrodzonych wad kończyn u ludzi

Projekt finansowany przez Narodowe Centrum Nauki w ramach konkursu SONATA BIS

Numer projektu: UMO-2016/22/E/NZ5/00270

Kierownik projektu: dr hab. n. med. Aleksander Jamsheer

Czas trwania projektu: 2017-2020

1. Cel badań/Hipoteza

Obustronne wrodzone wady kończyn (WWK) są w znacznym odsetku przypadków uwarunkowane genetycznie. Pomimo postępu wiedzy w zakresie genetyki człowieka oraz ciągłego udoskonalania metod diagnostyki genetycznej, przyczyna genetyczna wady pozostaje niezidentyfikowana u ok. 40-70% pacjentów z WWK, zależnie od typu wady. W niektórych podtypach WWK (np. izolowany rozszczep rąk/stóp, brak kości promieniowych, niedorozwój kości łokciowych) uwarunkowanie genetyczne jest nieznane u większości pacjentów. Co ważne, większość opublikowanych w ostatniej dekadzie badań naukowych odkrywających nowe genetyczne przyczyny WWK była prowadzona z wykorzystaniem metody mikromacierzy CGH (array CGH) i – jako czynniki sprawcze wady – identyfikowała tzw. warianty liczby kopii (CNVs), tj. małe ubytki lub naddatki określonych segmentów DNA. Tego rodzaju zmiany, zaburzając otoczenie regulatorowe genu lub genów, skutkowały ich nieprawidłowym działaniem w trakcie rozwoju zarodkowego. Inne badania wykonywane w ostatnich latach przy użyciu sekwencjonowania eksomowego (WES, tj. metody polegającej na analizie kodujących białka fragmentów materiału genetycznego) wykazały ograniczoną skuteczność tego podejścia diagnostycznego, sugerując że zmiany przyczynowe w WWK zlokalizowane są prawdopodobnie w niekodującym DNA. Całościowe badania interakcji wewnątrzgenomowych, przeprowadzone z wykorzystaniem metod uchwycenia konformacji chromosomów (np. Hi-C lub 4C), ujawniły, że genom ssaczy podzielony jest na „partycje” w postaci tzw. domen topologicznych (tzw. TAD). Uszkodzenie granic TAD-ów może zmieniać oddziaływania DNA-DNA w danym regionie genomu, prowadząc do zaburzeń regulacji genów rozwojowych, a w konsekwencji do rozwoju wady. W związku z powyższym zamierzamy przebadać grupę pacjentów z obustronnymi WWK, u których w kompleksowych badaniach genetycznych wykluczono wszystkie znane przyczyny wady. Planujemy wykonać badanie porównawczej hybrydyzacji genomowej do mikromacierzy (array CGH) w połączeniu z analizą bioinformatyczną i badaniami funkcjonalnymi, po to by:

[A] zidentyfikować nowe patogenne CNVs związane z wystąpieniem WWK u ludzi,  

[B] zidentyfikować nowe sekwencje regulatorowe odpowiedzialne za tworzenie się kończyn,   

[C] uzyskać wgląd w mechanizmy leżące u podłoża prawidłowej i zaburzonej morfogenezy kończyn u ludzi.

2. Metoda badawcza

Grupa ok. 150 probandów z WWK (przypadki rodzinne i sporadyczne) zostanie objęta badaniami. Kolejność diagnostyki będzie zależna od fenotypu pacjenta, tj. rozpoczynana od badania genów lub regionów, w których obecność mutacji jest najbardziej prawdopodobna. W ramach projektu, planowane jest wykonanie sekwencjonowania metodą Sangera oraz analizy liczby kopii metodami MLPA lub qPCR (ilościowy PCR) wytypowanych do badań genów i regionów. Ponieważ submikroskopowe CNVs odpowiadają za ok. 10-15% przypadków wady, u wszystkich niezdiagnozowanych probandów wykonane zostanie badanie array CGH (o rozdzielczości min. 1M), jako końcowy etap badań genetycznych. Zamierzamy wykorzystać array CGH do przebadania ok. 100 probandów i qPCR do badań rodziców. Nowo zidentyfikowane, potencjalnie patogenne CNVs zostaną poddane analizie bioinformatycznej celem sprawdzenia czy naruszają one granice TAD-ów i zmieniają otoczenie regulatorowe genów, co w konsekwencji mogłoby prowadzić do zaburzeń regulacji genowej w danym locus poprzez tzw. „adopcję enhancera”. W przypadku identyfikacji obiecujących kandydatów (genów lub sekwencji regulatorowych), przeprowadzone zostaną badania funkcjonalne oraz odpowiednie badania celowane u pacjentów manifestujących określone, zbliżone klinicznie fenotypy. By udokumentować związek domniemanych mutacji regulatorowych z obecnością wady użyjemy metody 4C (ang. circularized chromosome conformation capture), która pozwala na identyfikację zmian oddziaływań wewnątrzchromosomowych w komórkach pacjentów (fibroblasy, LCLs) względem komórek zdrowych osób. Na koniec planujemy odwzorowywanie CNVs w modelu mysim, wykorzystując technologię CRISPR-Cas9.

3. Wpływ rezultatów

Identyfikacja nowych zmian genetycznych odpowiedzialnych za morfogenezę kończyn będzie stanowiła istotny wkład w dziedziny genetyki klinicznej, biologii rozwoju i genetyki rozwoju. Uzyskane wyniki poszerzą wiedzę o wrodzonych wadach rozwojowych człowieka, jak również pozwolą uzyskać wgląd w procesy regulacji genów rozwojowych oraz mechanizmy embriogenezy kończyn człowieka i innych kręgowców. Co więcej, dzięki wynikom badań, pacjenci z WWK i ich rodziny uzyskają lepszą opiekę medyczną i bardziej wiarygodne poradnictwo genetyczne. Oczekuje się, że wyniki projektu umożliwią opracowanie i wprowadzenie nowych, bardziej kompleksowych testów genetycznych (obejmujących także niekodujące fragmenty genomu), co poprawi stan diagnostyki genetycznej i poradnictwa, które może być w pełni wiarygodne jedynie wówczas, gdy opiera się na wynikach odpowiednich badań. Dzięki umożliwieniu polskim pacjentom/rodzinom z WWK dostępu do kompleksowej diagnostyki genetycznej, będziemy mogli osiągnąć wysoki wskaźnik sukcesu diagnostycznego, a w konsekwencji umożliwić przeprowadzenie diagnostyki prenatalnej lub preimplantacyjnej. Podsumowując, lepsze zrozumienie etiologii genetycznej WWK, oprócz istotnego wkładu w rozwój nauk podstawowych, bez wątpienia przyczyni się do poprawy stanu opieki genetycznej nad chorymi oraz umożliwi skuteczniejszą diagnostykę, prognozowanie, leczenie i poradnictwo genetyczne w tej heterogennej grupie zaburzeń rozwojowych.

Publikacje powstałe w ramach realizacji projektu:

Holder-Espinasse M, Jamsheer A, Escande F, Andrieux J, Petit F, Sowinska-Seidler A, Socha M, Jakubiuk-Tomaszuk A, Gerard M, Mathieu-Dramard M, Cormier-Daire V, Verloes A, Toutain A, Plessis G, Jonveaux P, Baumann C, David A, Farra C, Colin E, Jacquemont S, Rossi A, Mansour S, Ghali N, Moncla A, Lahiri N, Hurst J, Pollina E, Patch C, Ahn JW, Valat AS, Mezel A, Bourgeot P, Zhang D, Manouvrier-Hanu S. Duplication of 10q24 locus: broadening the clinical and radiological spectrum. Eur J Hum Genet. 2019 Apr;27(4):525-534. doi: 10.1038/s41431-018-0326-9. Epub 2019 Jan 8. PMID: 30622331; PMCID: PMC6460637.

Flöttmann R, Kragesteen BK, Geuer S, Socha M, Allou L, Sowińska-Seidler A, Bosquillon de Jarcy L, Wagner J, Jamsheer A, Oehl-Jaschkowitz B, Wittler L, de Silva D, Kurth I, Maya I, Santos-Simarro F, Hülsemann W, Klopocki E, Mountford R, Fryer A, Borck G, Horn D, Lapunzina P, Wilson M, Mascrez B, Duboule D, Mundlos S, Spielmann M. Noncoding copy-number variations are associated with congenital limb malformation. Genet Med. 2018 Jun;20(6):599-607. doi: 10.1038/gim.2017.154. Epub 2017 Oct 12. PMID: 29236091.

Sowińska-Seidler A, Olech EM, Socha M, Larysz D, Jamsheer A. Novel 1q22-q23.1 duplication in a patient with lambdoid and metopic craniosynostosis, muscular hypotonia, and psychomotor retardation. J Appl Genet. 2018 Aug;59(3):281-289. doi: 10.1007/s13353-018-0447-4. Epub 2018 May 29. Erratum in: J Appl Genet. 2018 Nov;59(4):525. PMID: 29845577; PMCID: PMC6060980.

Nagrody:

Nominacja do Polskiej Nagrody Inteligentnego Rozwoju 2019 w kategorii: Naukowiec przyszłości.